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日前，來(lái)自麻省總醫院的研究人員發(fā)現，對被稱(chēng)作 CRISPR-Cas RNA 指導的核酸酶（CRISPR-Cas RNA -guided nucleases, RGNs）的人工合成酶中的向導 RNA （guide RNA , gRNA ）組分的長(cháng)度進(jìn)行調整能夠顯著(zhù)性地降低在非靶位點(diǎn)上的 DNA 突變發(fā)生率。

    論文主要作者 Keith Joung 博士表示：“只需縮短 gRNA 靶向區域的長(cháng)度，在我們研究過(guò)的之前已知的所有脫靶位點(diǎn)（off-target site）上觀(guān)察到不想要的突變頻率下降。相比于全長(cháng)的 gRNA ,一些位點(diǎn)的突變頻率下降了 5000 倍乃至更多，而且重要的是，這些截斷的 gRNA ---我們稱(chēng)之為 tru-gRNA ---與全長(cháng) gRNA 一樣高效地找到事先確定的靶 DNA 片段。”

    CRISPR-Cas RGNs是將一種被稱(chēng)作 Cas9 的基因剪切酶和一段短的 RNA 片段結合在一起而形成的，能夠被用來(lái)誘導與該 RNA 片段互補的 DNA 片段產(chǎn)生斷裂以便引入基因變化。2013 年，Joung 研究小組就已報道，在人細胞中，CRISPR-Cas RGNs 也能夠導致與靶位點(diǎn)相差高達 5 個(gè)核苷酸的 DNA 序列發(fā)生突變，這就限制了它們的臨床應用。該研究小組隨后進(jìn)行追蹤研究以便驗證一種看似違反直覺(jué)的假設：縮短 gRNA 片段可能會(huì )降低脫靶突變。

    Joung 解釋道：“我們去年的一些實(shí)驗提示著(zhù)人們能夠讓 gRNA 互補區的一端錯配幾個(gè)核苷酸而不影響它的靶向活性。這就讓我們想要了解一下移除這些核苷酸是否能夠讓這種系統對剩余序列中的錯配更加敏感。”

    基于細菌物種用來(lái)抵抗其他致病原的一種天然系統，這種已被廣泛使用的 CRISPR-Cas RGNs 包括 gRNA 中的一個(gè)長(cháng) 20 個(gè)核苷酸的靶向區域。為了驗證這種假設，研究人員構建逐漸縮短的 RGNs,結果發(fā)現盡管具有長(cháng) 17 或 18 個(gè)核苷酸的靶向片段的 gRNA 與全長(cháng) gRNA 一樣或者比全長(cháng) gRNA 更加高效地到達它們的靶位點(diǎn)，但是具有長(cháng) 15 或 16 個(gè)核苷酸的靶向片段的 gRNA 靶向活性下降或者丟失。隨后的實(shí)驗發(fā)現靶向片段長(cháng) 17 個(gè)核苷酸的截斷 RGNs 在人細胞中高效地誘導所需的突變，同時(shí)極大地降低脫靶效應或不能檢測到脫靶效應，即便是在只存在一兩個(gè)核苷酸錯配的位點(diǎn)，也是如此。

    Joung 表示：“盡管我們并沒(méi)有充分地理解 tru-gRNA 降低脫靶效應的機制，但是我們的假設是這種原先[未截斷]的系統可能具有比它所需更多的能量，從而能夠讓它切割甚至不完全匹配的位點(diǎn)。通過(guò)縮短 gRNA ,我們可能將這種能量降低到剛好足以實(shí)現靶向活性的水平，從而讓這種核酸酶更不可能切割脫靶位點(diǎn)。但是，還需更多的研究來(lái)精確地確定 tru-gRNA 為何能夠降低脫靶效應。”